2014 Коронавирус патент US-2017216427-A1

• • [0001]
    Настоящее изобретение относится к аттенуированному коронавирусу, содержащему вариантный ген репликазы, который вызывает снижение патогенности вируса. Настоящее изобретение также относится к применению такого коронавируса в вакцине для предотвращения и / или лечения заболевания.

ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

• • [0002]
    Вирус птичьего инфекционного бронхита (ВБК), этиологический агент инфекционного бронхита (ИБ), является высокоинфекционным и заразным патогеном домашних птиц, который размножается в основном в дыхательных путях, а также в эпителиальных клетках кишечника, почек и яйцевода. IBV является членом отряда Nidovirales, семейства Coronaviridae, подсемейства Corona virinae и родаGammacoronavirus ; генетически очень похожие коронавирусы вызывают заболевания у индеек, цесарок и фазанов.
  • [0003]
    Клинические признаки ИБ включают чихание, хрипы в трахее, выделения из носа и хрипы.Птицы мясного типа имеют меньшую прибавку в весе, в то время как птицы-несушки откладывают меньше яиц и производят яйца низкого качества.Респираторная инфекция предрасполагает цыплят к вторичным бактериальным инфекциям, которые могут быть смертельными для цыплят. Вирус также может вызвать необратимое повреждение яйцевода, особенно у цыплят, что приведет к снижению яйценоскости и качества; и почек, что иногда приводит к заболеванию почек, которое может быть фатальным.
  • [0004]
    Сообщается, что IBV несет больше экономических потерь для птицеводства, чем любое другое инфекционное заболевание.Хотя живые аттенуированные вакцины и инактивированные вакцины повсеместно используются для борьбы с ИБК, защита, полученная с помощью вакцинации, может быть потеряна либо из-за распада вакцины, либо из-за введения нового серотипа ИБК, не связанного с используемой вакциной, что создает риск для птицеводства.
  • [0005]
    Кроме того, в отрасли существует потребность в разработке вакцин, пригодных для использования in ovo, чтобы повысить эффективность и рентабельность программ вакцинации. Основная проблема, связанная с вакцинацией in ovo, заключается в том, что вирус должен быть способен к репликации в присутствии материнских антител против вируса, не являясь патогенным для эмбриона.Современные вакцины против IBV получают после многократного пассажа в яйцах с зародышами, что приводит к вирусам с пониженной патогенностью для цыплят, так что их можно использовать в качестве живых аттенуированных вакцин. Однако такие вирусы почти всегда проявляют повышенную вирулентность для эмбрионов и поэтому не могут использоваться для вакцинации внутрияцеклеток, поскольку они вызывают снижение выводимости. В некоторых случаях наблюдается снижение выводимости на 70%.
  • [0006]
    Ослабление после многократного пассажа в яйцах с зародышем также страдает другими недостатками. Это эмпирический метод, поскольку ослабление вирусов является случайным и будет различаться каждый раз при пассировании вируса, поэтому прохождение одного и того же вируса через другую серию яиц для целей ослабления приведет к другому набору мутаций, ведущих к ослаблению. С этим процессом также связаны проблемы с эффективностью: некоторые мутации будут влиять на репликацию вируса, а некоторые мутации могут сделать вирус слишком аттенуированным. В гене S также могут возникать мутации, которые также могут влиять на иммуногенность, так что нарушается желаемый иммунный ответ и потенциальная вакцина может не защищать от требуемого серотипа. Кроме того, существуют проблемы, связанные с возвращением вирулентности и стабильности вакцин.
  • [0007]
    Важно, чтобы были разработаны новые и более безопасные вакцины для борьбы с By.Таким образом, существует потребность в вакцинах против IBV, которые не связаны с этими проблемами, в частности в вакцинах, которые можно использовать для вакцинации in ova.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ АСПЕКТОВ ИЗОБРЕТЕНИЯ

• • [0008]
    Авторы настоящего изобретения использовали подход обратной генетики для рационального ослабления IBV. Этот подход гораздо более контролируем, чем случайное ослабление после нескольких пассажей в яйцах с зародышем, потому что положение каждой мутации известно и ее влияние на вирус, т. Е. Причину ослабления, можно определить.
  • [0009]
    Используя свой подход обратной генетики, авторы настоящего изобретения идентифицировали различные мутации, которые вызывают снижение уровня патогенности вируса. Уровни патогенности могут быть снижены, так что при введении вируса в яйцо с зародышем он может реплицироваться, не будучи патогенным для эмбриона. Такие вирусы могут подходить для вакцинации in ova, что является значительным преимуществом и имеет преимущества по сравнению с аттенуированными вакцинами против IBV, полученными после многократного пассажа в яйцах с зародышем.
  • [0010]
    Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает живой аттенуированный коронавирус, содержащий вариантный ген репликазы, кодирующий полипротеины, содержащие мутацию в одном или нескольких неструктурных белках (nsp) -10, nsp-14, nsp-15. или нсп-16.
  • [0011]
    Вариант гена репликазы может кодировать белок, содержащий одну или несколько аминокислотных мутаций, выбранных из списка:
    • • Pro к Leu в положении 85 SEQ ID NO: 6,
      • Val в Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7;
      • Leu на Ile в положении 183 SEQ ID NO: 8;
      • Val в Ile в положении 209 SEQ ID NO: 9.
  • [0016]
    Ген репликазы может кодировать белок, содержащий аминокислотную мутацию Pro в Leu в положении 85 SEQ ID NO: 6.
  • [0017]
    Ген репликазы может кодировать белок, содержащий аминокислотные мутации от Val до Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7; Leu на Ile в положении 183 SEQ ID NO: 8; и Val к Ile в положении 209 SEQ ID NO: 9.
  • [0018]
    Ген репликазы может кодировать белок, содержащий аминокислотные мутации Pro в Leu в положении 85 SEQ ID NO: 6; Val в Leu в положении 393 SEQ ID NO: 7; Leu на Ile в положении 183 SEQ ID NO: 8; и Val к Ile в положении 209 SEQ ID NO: 9.
  • [0019]
    Ген репликазы может содержать одну или несколько нуклеотидных замен, выбранных из списка:
  • [0020]
    Нуклеотид C к Tat в положении 12137;
  • [0021]
    От G до C в положении нуклеотида 18114;
  • [0022]
    Т к А в положении нуклеотида 19047; а также
  • [0023]
    G к A в положении нуклеотида 20139;
  • [0024]
    по сравнению с последовательностью, представленной как SEQ ID NO: 1.
  • [0025]
    Коронавирус может быть вирусом инфекционного бронхита (ИБК).
  • [0026]
    Коронавирус может быть IBV M41.
  • [0027]
    Коронавирус может содержать белок S, по крайней мере, часть которого относится к серотипу IBV, отличному от M41.
  • [0028]
    Например, субъединица S 1 или весь белок S может происходить от серотипа IBV, отличного от M41.
  • [0029]
    Коронавирус согласно первому аспекту изобретения имеет пониженную патогенность по сравнению с коронавирусом, экспрессирующим соответствующую репликазу дикого типа, так что при введении вируса в яйцо с зародышем он способен реплицироваться, не будучи патогенным для эмбриона.
  • [0030]
    Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает вариантный ген репликазы, как определено в связи с первым аспектом изобретения.
  • [0031]
    В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает белок, кодируемый вариантом гена репликазы коронавируса в соответствии со вторым аспектом изобретения.
  • [0032]
    В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает плазмиду, содержащую ген репликазы согласно второму аспекту изобретения.
  • [0033]
    В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения коронавируса в соответствии с первым аспектом изобретения, который включает следующие этапы:
    • • (i) трансфекцию плазмиды согласно четвертому аспекту изобретения в клетку-хозяин;
      • (ii) заражение клетки-хозяина рекомбинирующим вирусом, содержащим геном штамма коронавируса с геном репликазы;
      • (iii) обеспечение возможности гомологичной рекомбинации между последовательностями гена репликазы в плазмиде и соответствующими последовательностями в геноме рекомбинирующего вируса для получения модифицированного гена репликазы; а также
      • (iv) отбор для рекомбинации вируса, содержащего модифицированный ген репликазы.
  • [0038]
    Рекомбинирующий вирус может быть вирусом осповакцины.
  • [0039]
    Метод также может включать в себя этап:
    • • (v) выделение рекомбинантного коронавируса, содержащего модифицированный ген репликазы, из ДНК рекомбинантного вируса со стадии (iv).
  • [0041]
    В шестом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку, способную продуцировать коронавирус в соответствии с первым аспектом изобретения.
  • [0042]
    В седьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает вакцину, содержащую коронавирус в соответствии с первым аспектом изобретения и фармацевтически приемлемый носитель.
  • [0043]
    В восьмом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения и / или предотвращения заболевания у субъекта, который включает стадию введения вакцины в соответствии с седьмым аспектом изобретения субъекту.
  • [0044]
    Дополнительные аспекты изобретения включают:
    • • вакцина согласно седьмому аспекту изобретения для применения при лечении и / или профилактике заболевания у субъекта.
      • использование коронавируса согласно первому аспекту изобретения при производстве вакцины для лечения и / или профилактики заболевания у субъекта.
  • [0047]
    Заболевание может быть инфекционным бронхитом (ИБ).
  • [0048]
    Способ введения вакцины может быть выбран из группы, состоящей из: введение глазных капель, интраназальное введение, введение питьевой воды, инъекция после вылупления и инъекция in ovo.
  • [0049]
    Вакцинация может осуществляться путем вакцинации яйцеклеток.
  • [0050]
    Настоящее изобретение также обеспечивает способ получения вакцины согласно седьмому аспекту изобретения, который включает стадию инфицирования клетки согласно шестому аспекту изобретения коронавирусом согласно первому аспекту изобретения.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ